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    如何減少ELISA試劑盒背景因素的影響?

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      ELISA試劑盒的實驗原理在我們平時看來覺得很簡單,無非就是固定抗原,添加一抗、二抗和底物,間中夾雜著洗滌和閉。然而,即使是平常的洗滌和封閉,如果做得不太好,也有可能影響整個實驗。在做完實驗時,我們是否能獲得有用的信息,這在很大程度上取決于結果的信噪比。背景噪音會直接關系到結果的判斷。那么怎樣才能降低ELISA試劑盒實驗中的背景因素呢,下面我們來仔細說說。
     
      1.洗滌
     
      洗滌步驟看似很無聊,其實很重要,因為如果未結合的材料(如非特異結合的抗體或檢測試劑)殘留在微孔板中,那么它會增加背景噪音。如有必要,可增加洗滌液中的鹽濃度,這會阻止非特異結合反應。如果背景過高,而您懷疑洗滌不夠時,可以嘗試增加洗滌次數。
     
      2.封閉
     
      封閉液的作用是讓不相關的蛋白占據微孔板中潛在的結合位點。這就降低了可產生信號的抗體非特異結合的機會。您當然也希望抗體只與目的蛋白結合吧。如果您的背景過高,懷疑封閉不充分,那么您可以嘗試使用更高濃度的封閉液,或適當延長封閉時間。如果您一直被背景問題所困擾,那么也許您該花些時間來優化封閉液。這可能需要時間,但也是值得的。目前主要有兩種類型的封閉液:蛋白和非離子型去污劑。您使用的類型須取決于多個因素,包括微孔板的表面試劑、吸附的抗原、您的抗體和檢測試劑。好的封閉液應降低非特異性結合,但它不應當與抗原、抗體或檢測試劑發生相互作用。zui常用的非離子型去污劑是Tween-20。這種封閉液便宜、穩定,在去除洗滌過程中的一些非特異結合上很有用。但它們只在存在時起作用,因為很容易被洗掉。因此所有洗滌液中也必須添加封閉液。請勿使用高濃度(正常濃度為0.01-0.1%),它會降低特異結合,產生假陰性。另一個選擇是使用蛋白和非離子型去污劑這兩種封閉液,后者可協助洗滌過程中的封閉。蛋白封閉液則有所不同。它們與開放位點結合并封閉,同時穩定與微孔板結合的抗原分子。常用的蛋白封閉液包括牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、正常血清和魚明膠。
     
      3.抗體濃度
     
      如果試劑稍有不同,則可能需要優化抗體的量。記住,非特異的抗體結合會增加背景。為了防止這一點,切勿使用過多的一抗或二抗。
     
      4.檢測試劑
     
      另一點也很顯而易見:切勿使用過多的檢測試劑。如果濃度過高,或者未正確稀釋,則會導致高背景。也不要顯色過度,如有必要,優化一下何時應加入終止液。
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